在分子生物學(xué)中，載體是一種可以攜帶外源核酸序列進(jìn)入靶細(xì)胞中的物質(zhì)，有質(zhì)粒DNA載體、人工染色體載體、病毒載體等多種形式。基因工程最常使用的載體是質(zhì)粒DNA載體，通常包含復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、篩選標(biāo)記等多種載體元件。構(gòu)建質(zhì)粒DNA載體的目的即是要將外源DNA片段插入到質(zhì)粒骨架上。該質(zhì)粒可以在宿主菌中自我復(fù)制，并且在一些情形下進(jìn)一步用于下游的細(xì)胞轉(zhuǎn)染或者病毒包裝等實(shí)驗(yàn)，從而實(shí)現(xiàn)外源DNA在靶細(xì)胞中的表達(dá)。
 
傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室方法構(gòu)建含有目的基因的重組質(zhì)粒DNA載體一般采用酶切連接法，其操作流程概括如下：
 
1、用一定量的DNA限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒，使質(zhì)粒出現(xiàn)缺口，切口處的黏性末端暴露；
2、再用DNA限制性內(nèi)切酶處理目的基因的DNA片段，使其產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的黏性末端；
3、將處理好目的基因片段以與切割好的質(zhì)粒混合。目的基因片段的黏性末端和質(zhì)粒切口的黏性末端互補(bǔ)配對(duì)；
4、再加入適量的DNA連接酶，催化目的基因片段和質(zhì)粒DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵，從而將相鄰的脫氧核糖核酸連接起來，形成一個(gè)重組質(zhì)粒DNA分子。
5. 重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌并擴(kuò)增，然后篩選轉(zhuǎn)化后的克隆并驗(yàn)證目的基因的連接效果。
 
對(duì)比效率較低的酶切連接法，云舟生物可使用多種高通量策略進(jìn)行載體克隆。在我們的高度優(yōu)化的克隆平臺(tái)上，一般的表達(dá)載體我們使用Gateway克隆和Gibson組裝等方式構(gòu)建，而shRNA和gRNA載體則使用基于直接連接的方式快速構(gòu)建。此外，根據(jù)具體項(xiàng)目的需要，我們也可以使用從頭基因合成、Golden Gate等方式構(gòu)建載體。